Jump to content
  • Создайте аккаунт или войдите в него для комментирования

    Пройдите простую регистрацию, чтобы начать общение уже сейчас.

Sweet lab. - "Драма идей"


Recommended Posts

В 30.09.2020 в 19:34, Sweet сказал:

Когда дело доходит до наших членов, нам нужно работать с тканями, а не бороться с ними. На протяжении десятилетий мы использовали один и тот же варварский принцип борьбы с ним, безумными нагрузками и антинаучными подходами.

@Sweet Согласен полностью. Да ,не надо подниматься по лестнице жизни ч/з 3-4 ступени, лучше по одной и гарантированно поднимешься ,да и штаны не порвешь. Но ,когда поднимешься и увидишь,что те кто прыгал ч/з 4ступеньки их нет на этой площадке. Удачи!

  • Лайк 1
Link to comment

Sweet,быт походу каждый месяц находишь метод УВеличение пч,тебе скоро Оскара дадут 

  • Ржака 3
Link to comment

Его член понял, что у него нет другого выхода только как побыстрее вырасти и чтоб от он него остал. И можно будет болтаться как в старые времена и никто его мучать больше не будет. 

  • Лайк 1
  • Ржака 2
Link to comment

5 неделя

Понедельник:

Отдых.

Вторник:

Отдых.

Среда:

Пред BPFSL 18,7
Пост BPFSL 19,3
Деформация 3,2%.


Установка для снятия напряжения 40 мин (1 кг, 1,5 кг, 2 кг, 2,5 кг)
УЗ 15 мин влево 15 мин вправо (3/3,5кг).
Циклические растяжения 10 мин.

Четверг:

Пред BPFSL 18,7
Пост BPFSL 19,4
Деформация 3,74%.


Установка для снятия напряжения 40 мин (1 кг, 1,5 кг, 2 кг, 2,5 кг)
УЗ 15 мин влево 15 мин вправо (3/3,5кг).
Циклические растяжения 10 мин.

Хороший день, и во время циклических растяжений чувствовал болезненность во всех участках троса которые подвергались наивысшей температуре. После снятия тепла, трос минуты 2 был эластичнее прежнего.

Пятница:

Отдых.

Суббота:

Отдых.

Воскресенье:

Пред BPFSL 18,8
Пост BPFSL 19,4
Деформация 3,19%.


Установка для снятия напряжения 40 мин (1 кг, 1,5 кг, 2 кг, 2,5 кг)
УЗ 15 мин влево 15 мин вправо (3,5/4кг).
Циклические растяжения 5 мин.

ПЧ отлично себя чувствовал, я ощущал что отдохнул, и во время циклических растяжений из-за сильного давления пошла кровь на пол, создал пузырь своими же руками. При снятии колпака пузыря не было. Нужно будет следить за головкой после 2-ого этапа и выгонять всю кровь из головки.

  • Лайк 3
Link to comment

@Sweet 

1 час назад, Sweet сказал:

Среда:

Пред BPFSL 18,7
Пост BPFSL 19,3
Деформация 3,2%.

1 час назад, Sweet сказал:

Четверг:

Пред BPFSL 18,7
Пост BPFSL 19,4
Деформация 3,74%.

Странно, что после тренировки в среду новый миллиметр не проявил себя в четверг. График 2/2 явно лучше заходит, чем чередующийся 2/1 на 2/2 и обратно.

1 час назад, Sweet сказал:

во время циклических растяжений из-за сильного давления пошла кровь на пол, создал пузырь своими же руками. При снятии колпака пузыря не было. Нужно будет следить за головкой после 2-ого этапа и выгонять всю кровь из головки.

А вот с этим моментом есть смысл быть внимательным. Могут возникнуть пятна. Стоит лишь не долечить пузыря, поделать мануалки и привет пятно, которое потом годами не сходит. В последний раз у меня было точно так же, почему и решил притормозить на недельку. Явного и отчётливого пятна нет, но вот едва заметный оттенок, отличающийся от основного, всё же выделяется.

Link to comment

Коллаген

Некоторые новички спрашивали у меня что я делаю, почему и с чего взял, что нужно именно так? Не понимая с чем работать - не стоит наедятся на результат. К сожалению, мои знания о коллагеновых структурах в оболочке в лучшем случае поверхностны но я не останавливаюсь в обучении. Известно, что молекулы коллагена выстраиваются в тройные спирали, образуя микрофибриллы, которые затем делают то же самое, чтобы сформировать фибриллы, которые затем делают то же самое, чтобы сформировать полные волокна, которые затем выстраиваются в пучки. Они выравниваются для любой ткани, частью которой они являются. Таким образом, это похоже на пучок нитей, которые связаны конец к концу и вплетены в малые веревки, которая затем вплетены в более крупную, и так до той поры пока они структурно не расположаться в функциональную ткань. Это простое описание. Это нужно хотя бы просто для того, чтобы понимать из чего состоит туника.

Здесь я могу поделиться с вами некоторыми микроскопическими изображения туники из исследования Пейрони. Я не буду давать определения гистологическим методам, так как видимо для всех читающих это не несёт никакого смысла.

Спойлер

Please register or login to see the hidden attachment.

Структурные изменения белковой оболочки полового члена: влияние болезни Пейрони, старения и импотенции

Цель. Изучить, влияют ли изменения в структуре белочной оболочки на развитие ЭД. Пациенты и методы. Оценивались образцы биопсии, взятые из оболочки 64 пациентов (как с возможностью к потенции, так и импотентных) с болезнью Пейрони и без нее. Образцы тканей окрашивали и исследовали под световой и электронной микроскопией, и концентрацию эластичных волокон, присутствующих в каждом, измеряли с использованием компьютерного анализа изображений. Результаты. Концентрация эластичных волокон была ниже у пациентов с импотенцией, чем у здоровых (P-0,0365), а также была значительно ниже у пациентов с синдромом Пейрони. Кроме того, концентрация эластичных волокон снижалась с возрастом. Электронная и световая микроскопия выявила наличие отчетливых изменений в белочной оболочке у импотентов и пациентов с болезнью Пейрони, которые могут мешать функционированию. Заключение. Снижение концентрации эластичных волокон и изменения микроскопических характеристик могут способствовать эректильной дисфункции за счет нарушения веноокклюзионной функции белочной оболочки.

Введение

Кавернозное тело является основной эректильной тканью полового члена и состоит из трабекулярной гладкой мускулатуры и интерстициального матрикса, кровеносных сосудов, сосудистых простветов и нервных окончаний. Белочная оболочка - это фиброэластичная оболочка, окружающая губчатые гладкие мышцы. Несколько исследователей изучали её анатомию и гистологию. Оболочка играет важную роль в механизме эрекции, поскольку она важна для растяжимости, жесткости, эластичности полового члена и веноокклюзии. Она состоит в основном из толстых пучков каллагена и эластичных волокон. Первые расположены в два слоя; внутренний радиальный (круговой), внешний продольный. Волокна коллагена состоят из агрегатов молекул тропоколлагена и обычно расположены волнообразно в вялом состоянии. Хотя их прочность на растяжение велика, их упругость ограничена в результате их молекулярной конфигурации.

Эластичные волокна, которые состоят из эластина и микрофибрилл, могут растягиваться до 150% от их нормальной длины. Было показано, что эластичные волокна образуют нерегулярный, решетчатый каркас, на который опирается коллаген, обеспечивая волнообразный вид, наблюдаемый при световой микроскопии. Они особенно многочисленны между туникой и фасцией бака и переплетаются с коллагеном вдоль туничного ствола полового члена, то есть эластические волокна представляют собой взаимосвязанную сеть, которая удерживает коллагеновые пучки вместе.

Коллагеновые и эластические волокна белковой оболочки являются ключевыми структурами этой податливой ткани и допускают увеличение обхвата и длины во время эрекции, обеспечивая при этом достаточную упругость, чтобы быстро вернуться в вялое состояние с детумесценцией. Оболочка действует как волокнистый каркас, колонны которого проникают на различные глубины в кавернозное тело; таким образом, она предотвращает перенапряжение или сдавление сосудистых и нервных структур, находящихся под повышенным внутрикавернозным давлением во время эрекции. Дефекты в коллагеновых и эластических волокнах полового члена могут вызывать эректильную дисфункцию, поскольку они изменяют гемодинамику и податливость фиброэластического каркаса полового члена.

Обычно считается, что болезнь Пейрони является результатом воспалительного процесса неизвестного происхождения, поражающего белковую оболочку. Сообщается, что эта заболеваемость составляет 0,39-1% среди мужчин в возрасте от 40 до 70 лет. Несмотря на несколько теорий, точная причина все еще остается спорной. Недавние исследования показали, что повреждение микрососудов, приводящее к кровоизлиянию и последующему воспалению внутри оболочки, вызывает образование бляшек, хотя некоторые исследователи также предполагали аутоиммунитет.

Повреждение структур белковой оболочки с прогрессирующим сокращением эластических волокон и дезорганизацией коллагеновых пучков может быть причиной эректильной дисфункции у некоторых пациентов с болезнью Пейрони. Количественные и качественные изменения в коллагеновых и эластических волокнах могут привести к тому, что оболочка не сможет адекватно сжимать субтунические и эмиссарные вены, что приведет к веноокклюзионной дисфункции. Целью данного исследования было изучение микроскопических морфологических изменений в структуре оболочки, особенно эластических волокон, и их связи с болезнью Пейрони и импотенцией.

Пациенты и методы

Биопсии белковой оболочки были получены у 64 пациентов (средний возраст 54,5 года, диапазон 15-82 года), в том числе у 29 пациентов с болезнью Пейрони и у 35 пациентов без нее, перенесших реконструктивную операцию полового члена или установку протеза (у 21 была врожденная кривизна полового члена, у 10 - рак предстательной железы и у четырех - рак мочевого пузыря). Из пациентов с болезнью Пейрони 17 были импотентами и 12 с возможностью потенции); из тех, кто не был с БП, девять были импотентами и 26 с потенцией. 14 пациентов с раком предстательной железы или мочевого пузыря выбрали протез полового члена, установленный во время радикальной простатэктомии или цистэктомии, хотя не все из них были импотентами до операции. У пациентов с болезнью Пейрони биопсии были взяты из центра и края бляшки, а у пациентов без болезни Пейрони - из латеральной части среднего ствола.

Каждый образец фиксировали в нейтральном буферном формалине и обрабатывали для встраивания парафина. Срезы (5 мкм) приклеивали к заряженным предметным стеклам, депарафинизировали и гидратировали дистиллированной водой. Они были окрашены гематоксилином, эозином и пятном Харта. Срезы окрашивали в течение 5 мин раствором KMnO4, промывали водой и помещали в раствор щавелевой кислоты до тех пор, пока они не были очищены; затем их окрашивали в течение ночи в рабочем растворе резорцина-фуксина и после тщательной промывки повторно окрашивали в растворе Ван Гизена в течение 1 мин, затем обезвоживали и закрывали крышкой. При этом методе эластические волокна становятся сине-черными до голубого, ядра-синими до Черного, коллаген-розовым до красного, а другие тканевые элементы-желтыми. Некоторые образцы были разрезаны на 50-микрометровые секции, чтобы облегчить визуализацию сети эластичных волокон.

Гистологические картины коллагеновых и эластических волокон были исследованы при помощи световой микроскопии для определения структуры белковой оболочки. Совокупную площадь упругих волокон каждого образца оценивали в 10 случайных полях при увеличении 100×с помощью компьютерной системы обработки и анализа изображений (Quantimet 500+, Leica), подключенной к микроскопу (Leica).

Для электронной микроскопии ткань оболочки фиксировали путем мерцания в смеси 2% параформальдегида и 3% глутарового альдегида в 0,15 моль/л натриевого какодилатного буфера (рН 7,4). Образцы разрезали на 5-10 частей, постфиксировали в 2% тетроксиде осмия, обезвоживали в градуированном этаноле и окиси пропилена и погружали в Эпоксидный компаунд Эпон 812. Рандомизированные тканевые блоки от пациентов с болезнью Пейрони и без нее были срезаны толстым слоем (1 мкм) на Ультрамикротоме Sorvall MT2-B. Эти срезы окрашивали 1%-ным толуидиновым синим буром и оценивали методом световой микроскопии. Срезы, демонстрирующие наилучшую структурную консервацию, были исследованы на предмет архитектуры коллагеновых и эластических волокон. Для тонкого среза (900 нм) отбирали от одного до двух блоков, срезы устанавливали на 200-сетчатые медные сетки и окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца перед исследованием методом просвечивающей электронной микроскопии (Philips 300). Результаты статистически анализировались в зависимости от диагноза, потенции и возраста пациента с использованием регрессионных тестов Манна–Уитни; различия считались достоверными при р<0,05.

Результаты

Суммарная площадь эластических волокон была значительно меньше у импотентов, чем у сильных пациентов, со средней площадью 5575,3 (728,7) и 6951 (483) мкм2 соответственно (Р=0,0365), независимо от наличия или отсутствия болезни Пейрони. При сравнении пациентов с болезнью Пейрони и без нее (без учета состояния потенции) у первых была значительно меньшая площадь эластических волокон - 4205,5 (395,8) и 8204,7 (520,0) мкм2 соответственно (Р<0,001). В группе в целом концентрация эластических волокон достоверно снижалась с возрастом (r=0,576, Р<0,001). У молодых пациентов эластические волокна были длиннее и имели более правильную форму, чем у пожилых пациентов. Гистологическое исследование выявило различную картину микроскопических поражений в образцах: 1) нормальная туника имела волнообразные пучки коллагеновых волокон одинакового размера и сеть эластических волокон правильного размера, длины и направления, соединяющих коллагеновые волокна (Рис. 1).

Please register or login to see the hidden image.

(Рис. 1. a - нормальная белковая оболочка, показывающая волнистость коллагеновых волокон (сечение 5 мм, пятно Харта×100). b - сеть эластических волокон, которые являются регулярными и тонкими (сечение 50 мм, пятно Харта×100))

Между волнообразными пучками коллагена имелись небольшие промежутки. 2) у пациентов с болезнью Пейрони имелись признаки образования бляшек и некоторого обызвествления; эластические волокна были заметно меньше, фрагментированы или отсутствовали в бляшке. Коллагеновые волокна не имели волнистости и были плотными и упакованными; в упакованных участках наблюдалась субклеточная инфильтрация и отсутствовали промежутки между пучками коллагеновых волокон (Рис. 2).

Please register or login to see the hidden image.

(Рис. 2. Образование бляшек с кальцификацией при болезни Пейрони ×70)

3) у 21 из 26 пациентов с импотенцией (12 с синдромом Пейрони и девять без него) имелось несколько отчетливых патологических признаков, указывающих на патологию туники. Дезорганизованные эластические волокна различной длины и формы (фрагментированные, угловатые, спиральные) наблюдались у 11, а заметно более эластичные волокна наблюдались очагово в девяти (Рис. 3 и 4).

Please register or login to see the hidden image.

(Рис. 3. Туника, связанная с болезнью Пейрони, показывающая эластичные волокна, которые дезорганизованы, фрагментированы и имеют различную длину, размеры и ориентацию ×100)

Please register or login to see the hidden image.

(Рис. 4. Эта туника представляет те же особенности но без болезни Пейрони. Кроме того, коллагеновые волокна потеряли свою волнистость ×70)

Коллагеновые пучки были рассеяны и широко разделены у 15, а у семи пациентов их размер был неравномерным (Рис. 5).

Please register or login to see the hidden image.

(Рис. 5. Коллагеновые пучки этой туники широко разделены, имеют различные размеры и расположены равномерно ×100)

У всех 21 из этих импотентных пациентов волнообразность коллагеновых пучков была в той или иной степени утрачена (Рис. 4). Очагово эти патологические признаки сочетались в четырех образцах, а у некоторых пациентов были участки без специфической структуры коллагеновых и эластических волокон.

При электронной микроскопии нормальная белочная оболочка было обнаружено обилие измельченного вещества между коллагеновыми волокнами (рис. 6а). Однако в бляшки Пейрони коллагеновые волокна были упакованы вместе с небольшим количеством измельченного вещества между ними (рис. 6б). При более высоком увеличении нормальная оболочка показала эластичные волокна, окруженные свободно расположенными коллагеновыми волокнами и обильным измельченным веществом (рис. 6c); в плазме Пейрони были распространены упакованные коллагеновые волокна и нерегулярные, преждевременные и разорванные эластические волокна с небольшим количеством измельченного вещества (рис. 6d).

Please register or login to see the hidden image.

(Рис. 6. Электронная микрофотография нормальной белочной оболочки, показывающая при малом увеличении а - обилие измельченного вещества между коллагеновыми волокнами, в отличие от бляшки Пейрони,где коллагеновые волокна упакованы вместе. При большом увеличении нормальная туника показывает эластичное волокно, окруженное свободно расположенными коллагеновыми волокнами,c, тогда как в бляшке Пейрони коллагеновые волокна упакованы с небольшим количеством измельченного вещества между ними, а эластичные волокна меньше и нерегулярны, d)

Обсуждение

Белковая оболочка - это волокнистый каркас телесной оболочки и наиболее важная структура, способствующая жесткости во время эрекции. Коллаген и эластичные волокна служат его основными строительными блоками. Любые изменения в их структуре влияют на прочность на растяжение и эластичность пениса и могут привести к нарушению эрекции. Хотя коллагеновые волокна в изобилии присутствуют в нормальной оболочке и хорошо приспособлены для того, чтобы выдерживать окружные и продольные растягивающие напряжения, было высказано предположение, что эластичные волокна вносят больший вклад в способность выдерживать радиально сжимающие нагрузки.

Меньшее количество эластических волокон в белковой оболочке уменьшает комплаентность. Чтобы получить эрекцию в этих условиях, повышение внутрикавернозного давления должно быть более сильным, чем обычно, чтобы компенсировать его. Структурная упругость белковой оболочки может быть меньше из-за снижения концентрации эластических волокон, что затем ухудшит ее сжимающую функцию. При значительном снижении эластичности оболочки и отсутствии растяжения она может привести к нарушению веноокклюзионного механизма. Недавно Яконо и др. сообщили, что в биоптатах, взятых на расстоянии 2 см от бляшки у пациентов с болезнью Пейрони, было меньше эластических волокон. Это согласуется с настоящим наблюдением заметного снижения концентрации эластических волокон у пациентов с болезнью Пейрони (по сравнению с пациентами без нее) в образцах, взятых из центра и края бляшки. Также наблюдалось значительное снижение числа импотентов по сравнению со здоровыми пациентами в этой серии. Импотенция не может быть объяснена исключительно снижением эластичности волокон, но это, безусловно, является способствующим фактором. Однако мы предполагаем, что концентрация эластичных волокон может иметь критическое пороговое значение, которое влияет на эректильный механизм.

Настоящее исследование показало значительное снижение концентрации эластических волокон с возрастом. Из-за этого уменьшения эластических волокон ожидается снижение эластичности туники, хотя само по себе это, вероятно, не вызывает клинического беспокойства. Кроме того, молодые пациенты имели более длинные и более регулярные эластические волокна (по сравнению с короткими и фрагментированными эластическими волокнами у пожилых пациентов),что свидетельствует о возможном качественном эффекте старения.

Болезнь Пейрони может влиять на податливость и растяжимость белковой оболочки, нарушая волокнистую сеть. Гистологическое исследование бляшки показало дезорганизацию и гиалинизацию коллагеновых волокон и изменение эластиновых фибрилл используя электронную микроскопию, Ван ден Берг и др. сообщили о реорганизации интерстициального матрикса в сосудистых областях оболочки при болезни Пейрони. Настоящее исследование показывает, что коллагеновые волокна плотно упакованы с небольшим количеством измельченного вещества между ними, и что эластичные волокна часто ломаются, способствуя снижению способности туники правильно растягиваться. Эта упакованная конфигурация ограничивает волокна, не оставляя им возможности двигаться, создавая таким образом очаговую область дисфункции. Если эти признаки диффузны, то вено-окклюзионная функция будет нарушена.

У некоторых импотентных пациентов без болезни Пейрони в оболочке наблюдалось аномальное разделение коллагеновых пучков и участков без специфической коллагеновой и эластической структуры. Эти изменения можно было бы считать ранними фазами формирования Пейрони; действительно, мы предположили, что они представляют собой субклиническую болезнь Пейрони. Исследование с помощью световой микроскопии выявило отчетливые изменения микроструктуры оболочки у импотентов (как с болезнью Пейрони, так и без нее), помимо очевидного патологического эффекта у некоторых пациентов с болезнью Пейрони. Эти гистопатологические изменения позволяют предположить, что морфологические изменения оболочки могут быть дополнительным фактором нарушения эрекции. Уменьшение эластических волокон может уменьшить структурную упругость оболочки, но морфологические изменения в структуре оболочки также должны учитываться при оценке влияния на функцию. Тяжесть этих изменений будет определять клинический эффект. Если целостность туники достаточно изменена, может наступить импотенция.

*****

А здесь пара диаграмм, показывающих многоуровневую природу коллагеновых структур.

Please register or login to see the hidden image.

Please register or login to see the hidden image.

Некоторые электронно-микроскопические изображения макроуровня сухожилия:

Доказательства наличия структурно непрерывных коллагеновых фибрилл в сухожилиях

Краткое изложение

Сухожилия передают мышечную силу через внеклеточный матрикс выровненных коллагеновых фибрилл. Сила, приложенная мышцей на одном конце микроскопической фибриллы, должна передаваться через макроскопическую длину сухожилия с помощью механизмов, которые плохо изучены. Ключевым элементом в этой структурно-функциональной взаимосвязи является длина фибрилл коллагена. Во время эмбриогенеза образуются короткие фибриллы, но они быстро растут с созреванием. Существует некоторое противоречие относительно длины фибрилл во взрослом сухожилии, причем механические данные обычно поддерживают прерывистость, в то время как структурные исследования благоприятствуют непрерывности. Это исследование первоначально было направлено на то, чтобы проследить полную длину отдельных фибрилл в сухожилиях взрослого человека, используя последовательную блочную сканирующую электронную микроскопию. Но даже с этой передовой техникой требуемая длина не могла быть покрыта. Вместо этого был использован статистический подход к большому объему фибрилл в более коротких стеках изображений. Только один конец наблюдался после отслеживания 67,5 мм комбинированных длин фибрилл в поддержку непрерывности фибрилл. Чтобы пролить больше света на это наблюдение, была исследована полная длина короткого сухожилия (мышиный стапедий, 125 мкм) и подтверждена непрерывность отдельных фибрилл. В свете этих результатов обсуждаются возможные механизмы, которые могли бы примирить противоположные выводы о непрерывности фибрилл.

Заявление о значимости

Соединительные ткани удерживают все части тела вместе и в основном состоят из тонких нитей белка коллагена (называемых фибриллами). Соединительные ткани обеспечивают механическую прочность, и одной из самых требовательных тканей в этом отношении являются сухожилия, которые передают силы, создаваемые мышцами. Длина коллагеновых фибрилл имеет важное значение для механической прочности и типа повреждений, которые может испытывать ткань (проскальзывание коротких фибрилл или разрыв более длинных). Это, в свою очередь, важно для понимания процессов восстановления после такого повреждения. В настоящее время вопрос о длине фибрилл является спорным, но это исследование дает доказательства того, что фибриллы чрезвычайно длинные и, вероятно, непрерывные.

Вступление

Соединительные ткани играют решающую роль в поддержании структуры нашего организма. Умение буквально держать нас в форме не менее впечатляюще благодаря тому, что оно в значительной степени осуществляется одной группой белков, называемых коллагенами. В то время как у позвоночных существует 28 различных типов коллагена, это подгруппа фибриллярных коллагенов (тип I, II, III, V, XI), которая в основном отвечает за обеспечение механической прочности в больших масштабах. Различные фибриллярные коллагены имеют сходство в своей структуре и общем поведении, и хотя существуют важные различия, все они образуют удлиненные тройные спиральные молекулы, которые агрегируются в высокоупорядоченном порядке, образуя тонкие нити, называемые фибриллами. Эти фибриллы являются основными строительными блоками крупных соединительных тканей, таких как кожа, кости, хрящи и сухожилия. Сухожилия, возможно, являются одними из самых простых соединительных тканей с точки зрения структуры и состава, состоящих почти полностью из параллельных коллагеновых фибрилл 1-ого типа, с низкой скоростью оборота. Несмотря на эту кажущуюся простоту, фундаментальный вопрос остается без ответа: какова длина фибрилл? Диаметры фибрилл коллагена сухожилий обычно измеряются методом просвечивающей электронной микроскопии (40-400. Однако определение длины оказалось более трудным в первую очередь из-за того, что отдельные фибриллы слишком тонки для изображения методами световой микроскопии, они не могут быть извлечены неповрежденными из тканей, и они слишком длинны, чтобы проследить их с помощью обычной последовательной просвечивающей электронной микроскопии. Если бы длина зрелых фибрилл была порядка десятков или сотен микрон, то она, несомненно, была бы определена много лет назад, как это имеет место в эмбриональной ткани, где длина действительно находится в этом диапазоне.

Известно, что сухожилия обладают слабыми заживляющими свойствами, регенерируя медленно и часто с неполным восстановлением. Несколько факторов, вероятно, играют роль в этой плохой способности к заживлению, включая низкую плотность клеток и васкуляризацию, но сама структура сухожилия также может играть определенную роль из-за трудностей в выравнивании, натяжении и переплетении новых фибрилл через место разрыва. По этой причине длина коллагеновых фибрилл имеет важное значение для регенерации сухожилий, а также для определения того, как распределяется нагрузка через поперечные и продольные механизмы передачи.

Вопрос о длине фибрилл в зрелой ткани рассматривался в прошлом с помощью нескольких различных подходов. Прямые структурные исследования пытались проследить длину фибрилл с помощью сканирующей электронной микроскопии поверхностей разрушения, а также последовательного секционирования с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Длина фибрилл также была оценена косвенно на основе расчетов механических или структурных свойств. Другие исследования не оценивали численно длину, но пришли к выводу, что они разрывны по структурным и механическим соотношениям. Полученные результаты в целом согласуются с тем, что зрелые коллагеновые фибриллы имеют длину (>1 мм), однако прямые структурные исследования показывают достаточно высокие значения, указывающие на то, что фибриллы могут быть структурно непрерывными, тогда как те, которые основаны на более косвенных методах, как правило, поддерживают разрыв (длина < 10 мм).

Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы определить, являются ли зрелые коллагеновые фибриллы сухожилий человека структурно непрерывными, путем отслеживания отдельных коллагеновых фибрилл на расстояниях в сантиметровом диапазоне с использованием автоматизированных методов серийной визуализации электронной микроскопии. Проследить отдельные фибриллы на таких расстояниях оказалось невозможным, вместо этого непрерывность была исследована в гораздо более коротком (125 мкм) сухожилии мыши в сочетании со статистическим анализом зрелых фибрилл сухожилий человека, прослеженных на отрезках 25 мкм.

Материалы и методы

Человеческие сухожилия:

В рамках ранее опубликованного исследования сухожильная ткань у мужчин в возрасте от 18 до 32 лет была собрана во время обычной реконструкции передней крестообразной связки, а для настоящего исследования были исследованы сухожилие надколенника и сухожилие подколенного сухожилия. Эксперимент был одобрен этическим комитетом, и информированное согласие было получено от пациентов, как описано ранее. Сухожилие надколенника хранили замороженным при температуре -20 °C до использования, в то время как сухожилие подколенного сухожилия готовили свежим. Замороженное хранение повреждает клеточные структуры, но не оказывает заметного влияния на коллаген. Для сухожилия надколенника один пучок фиксировали в глутаральдегидном фиксаторе (2% В/В в 50 мм натрийфосфатном буфере, рН 7,2) при низком напряжении (0,2 Н) для улучшения выравнивания на большом расстоянии. По техническим причинам, описанным в обсуждении, мы отказались от использования стеков в миллиметровом диапазоне, избавившись от необходимости выравнивания на большие расстояния. Следовательно, сухожилие подколенного сухожилия фиксировалось непосредственно в глутаровом альдегиде без натяжения.

Мышинные сухожилия:

Двух зрелых 12-недельных мышей предварительно анестезировали ингаляцией Галотана 3% (Halocarbon Laboratories, River Edge, NJ, USA). Анестезия вызывалась внутрибрюшинным введением Пентотала натрия (Abbott Scandinavia AB, Швеция) в дозе 55 мг/кг массы тела. Мышей фиксировали путем сосудистой перфузии через левый желудочек сердца глутаральдегидным фиксатором в течение 5 мин. После фиксации стремена и стременная мышца с промежуточным сухожилием были выделены микродиссекцией из среднего уха (рис. 1А). Затем образцы переносили в гипотонический фиксатор (1% глутарового альдегида в 25 мм какодилатном буфере, рН 7,2) на 1 ч, чтобы помочь набухнуть сухожилию. Наконец, образцы были постфиксированы, окрашены, обезвожены и внедрены, как описано ниже.

Please register or login to see the hidden image.

(Рис. 1. Мышинное сухожилие. А) стереоскопическое изображение изолированного сухожилия (Tendon), прикрепленного к кости (Stapes) и мышце (M. Stapedius). (Б) электронный микроскоп 3D-рендеринга 5 коллагеновых фибрилл, которые были прослежены по всей длине сухожилия стапедиуса мыши. Область слева - это минерализованный фиброзный хрящ на конце кости.)

Пробоподготовка

Окрашивание и встраивание образцов для FIB-SEM осуществлялось по протоколу, аналогичному протоколу Старборга и др.. После первичной фиксации образцы промывали (3 × 20 мин) в 0,15 м фосфатном буфере (рН 7,2), фиксировали в 1% OsO4 с 0,05 м K3Fe(CN)6 в 0,12 м какодилатном буфере (рН 7,2) (1 ч) и затем промывали в дистиллированной воде (3 × 15 мин). Для усиления окрашивания образцы обрабатывали 1% дубильной кислотой в 0,1 м какодилатном буфере (рН 7,2) при температуре 4 °С (1 ч), промывали в дистиллированной воде (3 × 15 мин) и окрашивали в 1% OsO4 в дистиллированной воде (1 ч) с последующей другой промывкой в дистиллированной воде (3 × 15 мин). Наконец, образцы были блочно окрашены 1% - ным уранилацетатом в дистиллированной воде при температуре 4 °С в течение ночи и затем промыты в дистиллированной воде (3 × 15 мин). Окрашенные образцы обезвоживали в градиенте этанола (70% 2 × 15 мин, 96% 2 × 15 мин, 100% 3 × 15 мин), переносили в пропиленоксид (2 × 15 мин) и затем инфильтрировали градиентом эпоксидной смолы (TAAB 812, TAAB Laboratories Equipment Ltd, Англия) в пропиленоксид (25% 40 мин, 50% 40 мин, 75% 40 мин, 100% в течение ночи).

После эпоксидной инфильтрации образцы сухожилий человека помещали в форму, ориентированную для поперечного разрезания, и смола отверждалась при 60 °C в течение 24 ч. смоляные блоки обрезали лезвием бритвы, а для уменьшения “занавешивающих” артефактов тонкий слой свежей смолы наносили на срезанные поверхности и полимеризовали в течение 24 ч. Для образцов мышиного стапедиуса после эпоксидной инфильтрации, но до отверждения смолы, большая часть мышц и костей была обрезана. После частичного отверждения (12 ч, 60 °С) эпоксидный блок был обрезан до минимального размера параллельно сухожилию и полностью отвержден (24 ч, 60 °С). Перед окончательным получением изображения блоки были покрыты напылением золота толщиной 4 Нм (Leica ACE 200, Вена, Австрия).

Последовательная визуализация

Для визуализации коллагеновых фибрилл сухожилий человека в трех измерениях использовали комбинированный сфокусированный ионный пучок и сканирующий электронный микроскоп (FIB-SEM) для получения серийных блочных изображений лица (Quanta FEG 3D, FEI, Эйндховен, Нидерланды). Вкратце, после широкого ионного пучкового шероховатости открытой поверхности образца было выбрано поле с четко определенной площадью фибрилл. Платину (1 мкм) наносили на плоскую поверхность, перпендикулярную мезе, в поле, соответствующем предпочтительному увеличению. Траншеи были фрезерованы с обеих сторон осаждения платины. Наконец, фидуциальный был обрушенный на платиновый слой для облегчения юстировки.

Стеки изображений (500-1000 изображений) были получены с помощью программного пакета Slice and View G2 (FEI) путем последовательного фрезерования срезов толщиной 30 или 50 Нм с поверхности блока пучком ионов галлия. Между каждым кусочком поверхность блоков была просмотрена электронного пучка и изображения собраны в выдвижной детектор обратно-рассеянных электронов (видеодисков, Фэй). Электронный пучок работал в точке высокого напряжения 1, 5 кв (HT) при давлении в камере 0,3 МПа. Ионный пучок работал при напряжении 0,5 nA, 30,0 кв HT и рабочем расстоянии 10 мм. Изображения в серой шкале были записаны с 8 битами, 2048×1768 пикселями и временем выдержки 3,0 МКС. Ширина горизонтального поля варьировалась между стеками, но обычно составляла около 5 мкм, с размерами пикселей ≈ 3-5 Нм/пиксель.

Для мышиного сухожилия стапедиуса использовалось различное оборудование. Для получения серийных срезов использовался микроскоп Quanta 250 FEG (FEI), оснащенный ультрамикротомом 3view (Gatan, Великобритания). Микроскоп работал в точках 3,5, 4,0 кВ, при низком вакууме (45 па). Изображения собирали после каждого среза длиной 100 нм с помощью программного обеспечения DigitalMicrograph (Gatan, Великобритания). Первоначально был сделан пакет с полем зрения 120 мкм × 120 мкм2, чтобы содержать все сухожилие стапедия, но при таком увеличении оказалось невозможным проследить отдельные фибриллы. Стек, используемый в настоящем исследовании, выбрал меньшую область (6000×6000 пикселей при 5,2 Нм, что соответствует ≈ 30 мкм × 30 мкм), однако из-за меньшего поля зрения вставка сухожилия в мышцу изначально была пропущена. Следовательно, стек начинается на несколько микрометров ниже мышечной вставки. Поле зрения пришлось вручную регулировать еще 6 раз во время записи, чтобы держать сухожилие в поле зрения. Необработанные данные были преобразованы в стек MRC и отдельные области перестроены с использованием IMOD, как у Старборга и др..

Анализ структурных особенностей

Все стеки изображений были проанализированы с помощью программного обеспечения Amira (V. 5.4, FEI). Отдельные фибриллы были выбраны на первом кадре и прослежены вручную через стопки изображений, чтобы определить концы фибрилл и другие структурные особенности. Первоначально были предприняты попытки определить целесообразность автоматизированной процедуры трассировки, но контраст, разрешение и качество изображений не позволяли последовательно успешно проводить автоматизированную сегментацию, которая требуется для отслеживания структур на нескольких сотнях изображений. Преимуществом ручной трассировки является главным образом включение логики, т. е. когда несколько маленьких фибрилл сходятся в один неразличимый пучок над частью стопки, но позже разделяются на такое же количество фибрилл с теми же соответствующими размерами, было сделано заключение, что они являются одними и теми же непрерывными фибриллами. Вполне возможно, что можно было бы разработать более продвинутый алгоритм отслеживания, включающий такую логику.

Средняя длина фибрилл оценивалась на основе статистических данных с использованием количества наблюдаемых концов и комбинированной длины исследуемых фибрилл. Формула по существу та же, что и ранее полученная Старборгом и др., но поскольку в настоящем исследовании прослеживаются только фибриллы из верхней рамки в стеке, будет наблюдаться только половина концов, и поэтому оценка длины уменьшается вдвое. Основные предположения заключаются в том, что концы фибрилл равномерно распределены в ткани, что фибриллы по отдельности длиннее, чем в пучке, и что их длины равномерно распределены вокруг среднего значения.

Please register or login to see the hidden image.

LFibril - это расчетная средняя длина фибриллы в образце, LCombined - это суммарная длина всех прослеживаемых сегментов фибрилл, а nEnds - наблюдаемое число концов среди прослеживаемых сегментов.

Размеры фибрилл

Изменения диаметра фибрилл по их длине измерялись в сухожилиях человека полуавтоматическим и ручным способом. В полуавтоматическом методе из стека изображений были взяты пять равноудаленных срезов (примерно на глубине 0, 6, 12, 18 и 24 мкм), и каждый срез был проанализирован в ImageJ (V. 1.46 r, Национальный институт здравоохранения, США). Сегментация включала сглаживание сечения с помощью фильтра Despeckle и гауссовского размытия с последующим вычитанием фона на основе движущегося конуса. Изображения были впоследствии пороговыми, и коалесцированные фибриллы были разделены с функцией водораздела. Наконец, функция анализа частиц использовалась для определения площади поперечного сечения каждой фибриллы. В каждом из сухожилий надколенника и подколенного сухожилия вручную регистрировали 100 фибрилл для определения соответствующих фибрилл в каждом срезе. Площади поперечного сечения были рассчитаны на диаметры, предполагающие круговую форму. Ручной метод был использован для получения более детального представления об изменениях размеров фибрилл по длине. Диаметр фибрилл измеряли вручную по всей пачке с интервалом 500 Нм. Фибриллы были довольно круглыми, когда отделялись, но они казались эллиптическими, когда частично сливались с соседними фибриллами. Поэтому был измерен наименьший диаметр. Такое же ручное измерение диаметра было также выполнено на 300 фибриллах из одного среза сухожилия стремени для сравнения.

Результаты

На всех срезах было прослежено 1021 единичная фибрилла на сухожилии подколенного сухожилия и 1680 на сухожилии надколенника, каждая из которых имела длину приблизительно 25 мкм при общей длине фибрилл 25,5 мм на сухожилии подколенного сухожилия и 42,0 мм на сухожилии надколенника (рис. 2 А-Б). Между этими двумя тканями не было никаких видимых различий, поэтому последующий анализ рассматривал их как одно целое. В дополнение к человеческим сухожилиям, 50 фибрилл были прослежены через мышиное сухожилие стапедиуса (длина сухожилия ≈ 125 мкм). Большинство этих фибрилл не могли быть прослежены по всей длине, потому что они либо расходились из поля зрения, входили в особенно размытую область изображения, либо были разрушены небольшими трещинами, которые, вероятно, образовались из-за напряжений в блоке образца во время секционирования микротома. Однако ни одна из фибрилл не имела реального конца, и 5 фибрилл были успешно прослежены по всей длине сухожилия (рис. 1Б).

Please register or login to see the hidden image.

(Рис. 2. Иллюстрация трассировки фибриллы через сухожилие. (А) первая секция в пучке FIB-SEM с областью ∼300 отдельных коллагеновых фибрилл, сегментированных вручную. Шкала бар = 1 мкм. (Б) те же самые фибриллы в 3D-рендеринге. Смотрите также дополнительные видеоролики 2 и 3.)

Структурная особенность

Среди всех прослеженных фибрилл был обнаружен один конец фибриллы, который находился в образце сухожилия надколенника. Оканчивающаяся фибрилла была тонкой (45 нм), но не проявляла заметной конусности. Фибрилла дважды изогнулась назад, один раз прямо перед окончанием и один раз примерно на 20 мкм глубже в образце (рис. 3 А-D). Было также замечено, что семь других фибрилл изгибаются назад, образуя петлю шпильки (4 в подколенном сухожилии и 3 в сухожилии надколенника) (рис. 4 А-С). Были обнаружены три фибриллы с грубо неправильной структурой (1 в подколенном сухожилии и 2 в сухожилии надколенника) (рис. 4 D-F). Наконец, точки ветвления фибрилл наблюдались в 4 случаях (все 4 в одном и том же стеке изображений на сухожилии надколенника) (рис. 5 А-D).

Please register or login to see the hidden image.

(Рис. 3. Иллюстрация единственного наблюдаемого конца фибриллы. А) 3D - рендеринг всей фибриллы, ширина изображения составляет 11 мкм. Он образует петлю шпильки как слева, так и справа. Стрелка отмечает конец. (B-D) последовательные срезы фибриллы (на расстоянии ≈ 500 Нм друг от друга) конца фибриллы. Стрелки отмечают окончание фибриллы. Шкала бар = 150 Нм. Смотрите также дополнительные видео 4 и 5.)

Please register or login to see the hidden image.

(Рис. 4. Наблюдаемые структурные особенности. (A-C) последовательные срезы FIB-SEM (на расстоянии ≈ 500 Нм друг от друга) через петлевую коллагеновую фибриллу. Фибрилла первоначально выглядит как две отдельные фибриллы одинакового размера. Затем две фибриллы сливаются, и в конце концов обе фибриллы исчезают. Стрелки отмечают петлевую фибриллу. Шкала бар = 500 Нм. См. также дополнительное видео 6. (D-F) последовательные срезы фибриллы (на расстоянии ≈ 500 Нм друг от друга), показывающие большую коллагеновую фибриллу, изменяющуюся от круглой к неправильной форме. Стрелками отмечены нерегулярные волоконца. Шкала бар = 500 Нм. Смотрите также дополнительное видео 7.)

Please register or login to see the hidden image.

(Рис. 5. Иллюстрация ветвящейся фибриллы. А) 3D-визуализация разветвленной фибриллы. Буквы обозначают примерное расположение изображений в B-D. (B-D) последовательные сечения FIB-SEM (на расстоянии ≈ 500 Нм друг от друга) точки ветвления. Стрелками отмечены первоначально слитые и впоследствии расщепленные фибриллы. Шкала бар = 150 Нм. Смотрите также дополнительное видео 8.)

Исходя из одного наблюдаемого конца фибриллы, расчетная длина фибриллы (уравнение (1)) равна общей прослеженной длине 67,5 мм. Из - за малого числа наблюдений статистическая достоверность этого числа невелика. Используя биномиальную статистику, 95% доверительный интервал может быть оценен путем нахождения наибольшей длины фибриллы (наименьшая вероятность конца), которая – с вероятностью 95% – дала бы менее одного наблюдаемого конца (верхний предел), или наименьшей длины фибриллы, которая – с вероятностью 95% – дала бы более одного наблюдаемого конца (нижний предел). При таком подходе 95% доверительный интервал по длине фибриллы составляет 14-1228 мм.

Поскольку верхний доверительный предел намного больше фактической длины сухожилия надколенника (≈50 мм), альтернативная интерпретация данных заключается в рассмотрении двух популяций фибрилл, одна из которых охватывает длину сухожилия и не имеет концов, а другая-прерывистая с длиной до 50 мм. При использовании этого подхода Нижний доверительный предел может быть описан 100% прерывистыми фибриллами со средней длиной 14 мм, среднее значение будет эквивалентно 26% непрерывных фибрилл и 74% прерывистых фибрилл с длиной 50 мм, а верхний доверительный предел будет соответствовать популяции 96% непрерывных фибрилл и 4% прерывистых фибрилл с длиной 50 мм. Если бы предполагаемая длина прерывистых фибрилл была короче, их доля также уменьшилась бы.

Размеры фибрилл по их длине

Средние значения для измеренных фибрилл сухожилий человека приведены в Таблице 1. Для выяснения размерной изменчивости коллагеновых фибрилл определяли стандартное отклонение и коэффициент вариации вдоль каждой фибриллы. Не было никакой связи между диаметром фибрилл и стандартным отклонением внутри фибрилл. Мы интерпретируем эту довольно постоянную дисперсию как неопределенность измерения, возникающую из-за несколько размытых очертаний фибрилл (рис. 3 B-D), а не из-за функциональной модуляции диаметра фибрилл. Ручные измерения диаметра вдоль фибрилл (рис. 6), обеспечивающие большее продольное разрешение (50 точек измерения против 5), хорошо согласуются с полуавтоматическим методом (табл. 1). В дополнение к изменчивости диаметра мы также исследовали, была ли видна конусность. Средний абсолютный наклон (т. е. не зависящий от направления конусности) составил 0,56 Нм/мкм. Предполагая, что конусность присутствует только вблизи окончания, большинство фибрилл не будут сужаться, и тогда максимальное значение 2,20 Нм/мкм будет более уместным. Полуавтоматический метод также обеспечивал координаты каждой фибриллы, и по ним мы определили, что сечения были отклонены от перпендикуляра примерно на 5°, что оказывает незначительное влияние на размеры диаметра (<0,5%). Фибриллы в сухожилии стапедиуса были тоньше и более однородны по размеру, чем в сухожилиях человека (табл. 1).

Таблица 1. Изменение размеров фибрилл по длине. Среднее значение (SD) [диапазон].

Please register or login to see the hidden image.

SD = стандартное отклонение, CV = коэффициент вариации, n = количество измеренных фибрилл. Наклон относится к общему изменению диаметра фибрилл вдоль сегментированной длины путем линейной регрессии. Абсолютное значение сообщается для устранения зависимости направления наклона.

* Обратите внимание, что абсолютные диаметры не отражают распределение фибрилл по диаметру в ткани, а только распределение фибрилл, используемых при анализе изменения длины.

Please register or login to see the hidden image.

(Рис. 6. ручное измерение диаметров фибрилл в сухожилии надколенника по длине пучка фибрилл - SEM. Каждая линия представляет одну фибриллу.)

Обсуждение

Длина фибрилл

Первоначальная цель этого исследования состояла в том, чтобы проследить отдельные коллагеновые фибриллы на макроскопических расстояниях, чтобы однозначно определить их длину, но даже с помощью современных передовых методов серийной визуализации мы не смогли достичь этого по ряду причин. Во-первых, с помощью метода FIB-SEM удаляется только меньшая область образца, и по мере углубления в пучек боковые стенки вызывают артефакты. Метод, основанный на микротоме, удаляет всю поверхность, но рискует повредить образец во время секционирования, потому что он должен быть длинным и тонким. Кроме того, первоначально мы ожидали, что изображение каждого участка займет около 1 мин, что приведет к 14-дневному времени сбора для образца длиной 2 мм, но для достижения достаточного качества изображения каждый участок на мышином стапедиусе занял около 4 мин (≈5 дней для образца 200 мкм). Кроме того, более глубокие стеки также потребовали бы больших областей изображения, поскольку отдельные фибриллы вплетаются и выходят из пучков, заставляя их “диффундировать” через большие части поперечного сечения образца, даже когда сам образец остается хорошо выровненным. Это означает, что если бы поле в два раза больше (60 мкм) должно было быть изображено с достаточным качеством, то это привело бы к времени получения ≈ 200 дней для образца длиной 2 мм. Поддержание качества изображения в течение столь длительного времени считалось неосуществимым. Следовательно, мы были низведены до статистического подхода, подобного тому, что было сделано в прошлом, но с более продвинутыми методами, позволяющими нам охватить больший объем, чем раньше. В силу большего объема исследования настоящие результаты выдвигают оценку длины фибриллы еще выше, от диапазона нескольких мм до диапазона десятков мм, со средним превышением длины по крайней мере сухожилия надколенника (≈50 мм). Следует иметь в виду, что достоверность длины фибрилл невелика, поэтому в пределах 95% доверительных пределов фибриллы могут быть уменьшены до 14 мм. Даже при этом пределе 14 мм все равно будет больше, чем было оценено ранее, и хотя фибриллы не будут структурно непрерывными, они почти наверняка останутся механически непрерывными, как описано далее в обсуждении. Другим спорным моментом является предположение, что концы фибрилл распределены равномерно, поскольку мы исследовали только центральную часть человеческих сухожилий. Насколько нам известно, нет никаких доказательств того, что концы будут локализованы в определенных областях, и неравномерное распределение концов фибрилл в целом будет вредно для механической прочности, поскольку области с более высокой плотностью концов станут слабыми точками. Независимо от средней длины фибрилл, статистический подход не может непосредственно показать, есть ли на самом деле непрерывные фибриллы, прикрепленные к мышце на одном конце и кости на другом. Чтобы помочь преодолеть этот разрыв, было исследовано сухожилие (мышиный стапедиус), которое находится в пределах достижимых размеров для последовательной визуализации (длина<200 мкм). Нам удалось проследить 5 фибрилл почти по всей длине сухожилия стапедия (пропуская первые несколько мкм при введении мышцы, как упоминалось ранее) и не наблюдали никаких концов, доказывая, что структурно непрерывные коллагеновые фибриллы существуют в некоторых сухожилиях. С точки зрения функции сухожилие стапедиуса не несет веса, как сухожилия надколенника и подколенного сухожилия, но морфологически оно аналогично (соединяя мышцу с костью) и имеет сходную микроструктуру плотных пучков коллагеновых фибрилл.

Сужаются или заканчиваются?

Обычно предполагается, что концы интактных фибрилл сужаются, и если они сужаются очень медленно, то они, по-видимому, медленно исчезают, а не заканчиваются, что может вызвать трудности в наблюдении за концами. Чтобы это было проблемой, конусность должна была бы происходить настолько медленно, что фибрилла была бы близка к пределу обнаружения метода визуализации по длине сегментированного объема. В настоящем исследовании большинство записей имели пиксельное разрешение приблизительно 5 нм, и фибрилла должна была бы иметь по крайней мере несколько пикселей в диаметре, чтобы быть разумно прослеживаемой, что привело бы к пределу обнаружения около 30 нм. Имеются ограниченные данные о конусности фибрилл, и, насколько нам известно, нет никаких данных о зрелых фибриллах, но исследование сухожилия цыпленка на 18-й день эмбриона изучило форму конусности фибрилл и обнаружило, что количество молекул в поперечном сечении фибрилл изменяется с постоянной скоростью вдоль конусности, что происходит примерно в течение 1 мкм (15 D-периодов) в фибриллах диаметром 30-40 нм. Сообщалось, что скорость конусности составляет 30 молекул на D-период 67 нм (450 молекул/мкм), и если предположить, что молекулы диаметром 1,5 нм плотно упакованы в фибриллу диаметром 100 нм (≈4500 молекул в поперечном сечении), то общая конусность растянется более чем на 10 мкм. Однако та часть, где диаметр фибриллы меньше 30 нм, будет меньше 1 мкм, поскольку постоянная скорость конусности в пересчете на молекулы приводит к параболической форме наконечника в пересчете на диаметр. Поэтому крайне маловероятно, что концы фибрилл были упущены из виду из-за сужения. Кроме того, диаметр фибрилл был довольно стабильным, по крайней мере, в течение десятков микрометров (10,6 нм SD) в соответствии с нашими предыдущими наблюдениями с использованием атомно-силовой микроскопии на отдельных фибриллах, и самая высокая скорость конусности, наблюдаемая здесь (2,2 нм/мкм), намного ниже, чем ожидалось ближе к концу.

Удлиняющие механизмы

Фибриллы явно увеличиваются в длину во время созревания, вероятно, путем слияния коротких сегментов фибрилл от кончика к кончику, как это видно в незрелой ткани:

в сочетании с аккрецией молекул коллагена на существующие фибриллы, как это видно во время восстановления коллагена в лаборатории.

Чтобы фибриллы эффективно укрепляли матрицу, этот процесс должен продолжаться по крайней мере до тех пор, пока фибриллы не достигнут критической длины; однако тот же самый процесс удлинения может продолжаться, и естественной конечной точкой будут структурно непрерывные фибриллы, как это предполагается настоящим открытием. Это кажется разумным процессом и позволит избежать необходимости в механизме для остановки удлинения фибрилл на некоторой желаемой длине. Однако, как представляется, такой механизм действительно существует. Молекулы внутри фибриллы обычно ориентированы в одном и том же направлении (униполярном), давая фибрилле С - и N-концевой конец, и ранее сообщалось, что сегменты фибриллы могут сливаться только кончик к кончику через с-кончик такой униполярной фибриллы. Фибриллы, сливающиеся между двумя с-концевыми концами, будут генерировать N-N биполярных фибрилл, которые не могут сливаться друг с другом, тем самым ограничивая продольный рост путем слияния. Существование такого механизма ограничения роста можно рассматривать как подтверждение концепции прерывистых фибрилл. Для решения этой проблемы потребуются дальнейшие исследования, но мы подозреваем, что контролируемое удлинение фибрилл может быть в первую очередь важно для обеспечения скольжения во время роста ткани, после чего фибриллы в конечном итоге удлиняются, чтобы стать непрерывными, как показывают настоящие результаты.

Другие структурные наблюдения

При прослеживании коллагеновых фибрилл был также замечен ряд других структурных особенностей, которые могут быть важны для функции сухожилий. Разветвленные коллагеновые фибриллы были зарегистрированы в прошлом и также наблюдались здесь, хотя распространенность в настоящем исследовании (1:250 000 D-периодов) была ниже, чем ранее сообщалось для эмбриональных мышиных хвостов (1:20 000 D-периодов). Неизвестно, представляет ли такая ветвь расщепление фибрилл, слияние или, возможно, место зарождения роста фибрилл. “Слитая” фибриллярная область в принципе могла быть двумя тесно связанными, но все же отдельными фибриллами; однако в 3 из 4 наблюдаемых ветвей фибриллы были одинакового размера, и поэтому слитая область должна была быть эллиптической, если бы они просто шли рядом друг с другом, что было не так. Во всех 4 случаях объединенная область имела больший диаметр, чем любая из двух ветвей, но только в одном случае объединенная площадь поперечного сечения была равна сумме ветвей, в остальных трех площадь составляла от 60% до 80% от суммы. Если ветви возникают случайным образом, то наблюдение, что фибриллы ветвятся чаще, чем заканчиваются, указывает на то, что они в среднем имеют точку ветвления, соединяющую их с соседней фибриллой перед окончанием. Как предполагалось ранее, это привело бы к структурно связанной разветвленной сети коллагеновых фибрилл. Однако наблюдение, что все фибриллярные ветви были обнаружены в пределах относительно небольшой области, может указывать на то, что они не возникают случайным образом. Альтернативная возможность заключается в том, что слияние фибрилл может быть механизмом восстановления локального повреждения фибрилл. Гипотеза состояла бы в том, что концы сломанной фибриллы сливаются со стволами соседних неповрежденных фибрилл для поддержания непрерывности. Механическое повреждение само по себе может способствовать этому механизму, разрушая протеогликаны, которые обычно удерживают фибриллы от слияния. Такой механизм позволил бы создать такую форму самовосстановления, которая не зависела бы от клеточной активности и оборота. У нас нет явных доказательств существования такого механизма, но в будущем его, возможно, стоит изучить. В предыдущем исследовании, которое может дать некоторую поддержку этой идее, сообщалось, что фибриллы в области рубца заживающих связок непрерывны с фибриллами в интактной ткани и что качественно наблюдается повышенное появление фибриллярных ветвей в области интерфейса.

В нескольких случаях было замечено, что фибриллы изгибаются в петлю, назад на себя, иногда продолжая весь путь назад через пучек, а иногда возвращаясь на несколько мкм, прежде чем сделать еще один поворот и снова продолжить через пучек в первоначальном направлении. Рассматриваемые фибриллы не были особенно тонкими (средний диаметр 93 нм) или какими-либо другими примечательными, что указывает на то, что это, вероятно, не просто субпопуляция “рыхлых” фибрилл. Наличие таких петель говорит о том, что фибриллы не натянуты внутри матрицы, но их происхождение не ясно. Мы подозреваем, что фибриллы различной длины существуют внутри сухожилия (даже если они непрерывны) и что они последовательно рекрутируются во время механического растяжения. В этом случае самые длинные фибриллы должны были бы сгибаться или сгибаться в ненагруженном сухожилии, что могло бы привести к появлению наблюдаемых петель на фибрилле. Разница в длине фибрилл может быть вызвана простым формированием непрямолинейных фибрилл, но также может возникнуть при образовании прямых фибрилл в растянутом состоянии сухожилия.

Непрерывные и прерывные фибриллы

В композиционном материаловедении ключевым понятием является “критическая длина”, определяемая как длина, при которой площадь поверхности волокна достаточно велика, чтобы прочность связи с окружающей его матрицей стала больше, чем прочность самого волокна. Волокно длиннее своей критической длины скорее сломается, чем соскользнет. Мало что известно о механизмах и величине передачи межфибриллярной сдвиговой нагрузки в сухожилиях. В недавнем исследовании использовался метод испытания на надрез для оценки межфибриллярной прочности на сдвиг 32 кПа в квазистатических условиях. Прочность коллагеновых фибрилл также слабо изучена, но мы ранее определили величину 540 МПа для гидратированных фибрилл сухожилий надколенника человека, нормализованных к их сухой площади поперечного сечения. Для нативного сухожилия следует использовать гидратированное поперечное сечение, и при условии увеличения диаметра на 30% после гидратации нативная прочность фибриллы становится 320 МПа. При среднем диаметре в настоящем исследовании 125 нм критическая длина может быть оценена как 625 мкм. Цифры, используемые в этом расчете, несколько неопределенны, но кажется справедливым предположить, что большинство фибрилл будет иметь критическую длину около 1 мм. Другие исследования, изучающие длину фибрилл в зрелой ткани, обнаружили значения в диапазоне 0,86–12,7 мм, указывающие на то, что большинство фибрилл может превышать свою критическую длину [13], [14], [15]

Это согласуется с наблюдением о том, что разорванные фибриллы можно выделить только из зрелых тканей сухожилия, однако это может быть высоковероятно ошибочно.

Объединяя эти соображения с данными настоящего исследования, можно сделать вывод, что в зрелом сухожилии многие фибриллы структурно непрерывны. К тому же они также механически непрерывны независимо от их структурной непрерывности, потому что их длины превышают критическую длину. Кроме того, даже с учетом их структурной непрерывности фибриллы не обязательно натянуты, но могут быть последовательно рекрутированы. В той мере, в какой фибриллы превышают критическую длину, разрушение будет происходить путем разрыва фибрилл, независимо от того, являются ли они непрерывными или нет, и когда фибриллы разрываются, непрерывность теряется, и нет никакого различия между непрерывными и прерывистыми случаями. То, что фибриллы нагружаются до своего механического предела, а не проскальзывают при разрушении сухожилий, подтверждается недавними исследованиями в искуственной среде на мертвой ткани, показывающими, что сухожилия, перегруженные в область пластической деформации, демонстрируют повреждение фибрилл в дискретных местах, которое увеличивается с частотой повторной перегрузки. Аналогичные локализованные повреждения были зарегистрированы много лет назад в сочетании с рентгеновской дифракцией, показав, что внутрифибриллярные механизмы повреждения-которые не изменяли средний D – период фибриллы (деформация)- предшествовали межфибриллярному скольжению и макроскопическому разрушению.

Основным аргументом против структурной непрерывности фибрилл является наблюдение, что сухожилия и связки могут ползти до разрушения даже при относительно низких нагрузках, и, кроме того, рентгеновская дифракция показала, что в то время как сухожилие удлиняется во время ползучести, D-период фибриллы (деформация фибриллы) остается постоянным. Такое поведение может быть объяснено проскальзыванием фибрилл, но если фибриллы непрерывны, они должны в конечном итоге стать тугими и сопротивляться дальнейшей деформации, прежде чем потерпеть неудачу. Отдельные фибриллы также проявляют вязкое поведение и могут сами ползти, что может объяснить макроскопическую ползучесть даже после того, как фибриллы натянуты. Однако такая внутрифибриллярная ползучесть привела бы к молекулярному скольжению и, вероятно, увеличила бы D-период, что не согласуется с рентгеновскими наблюдениями. Следует отметить, что в то время как D-период не увеличивался при рентгенологическом исследовании, наблюдались другие изменения дифракционной картины, указывающие на то, что некоторые структурные изменения происходили внутри фибриллы во время ползучести. Если эти изменения были связаны с локализованным повреждением фибрилл, как упоминалось ранее, то возможно, что отдельные фибриллы последовательно разрушаются в процессе ползучести, что приводит к разрывной структуре, которая может ползти дальше при межфибриллярном скольжении.

Вывод

Концы фибрилл коллагена в пределах зрелого человеческого сухожилия весьма редки, в согласии с предыдущими отчетами. Значительный объем фибрилл, исследованный в настоящем исследовании, дает статистические доказательства того, что фибриллы могут быть даже структурно непрерывными. Это открытие подтверждается нашими результатами на коротком мышином сухожилии стапедиуса, в котором непрерывность фибрилл можно было непосредственно наблюдать. В некоторых аспектах сухожилие ведет себя механически как материал с прерывистыми фибриллами; однако это наблюдение может быть объяснено, если локализованное повреждение приводит к последовательному разрыву коллагеновых фибрилл, что приводит к эффективному разрыву фибриллярной сети по мере накопления повреждений. Наши результаты подтверждают разрыв фибрилл, а не проскальзывание, как основной способ повреждения тканей, и поэтому следует ожидать, что механизмы поддержания и ремонта будут иметь дело с регенерацией сломанных фибрилл.

 

Please register or login to see the hidden video.

(Дополнительное видео 1. Видео проходит через стапедиус сухожилия мыши размером 125 мкм, показывая пять фибрилл, которые были прослежены по всей длине в 3D. Красная структура на конце-это кальцинированный фиброзный хрящ.)

 

Please register or login to see the hidden video.

(Дополнительное видео 2. Видео проходит через пучок 25 мкм на сухожилии подколенного сухожилия человека, показывая, как переплетаются фибриллы. Около 300 фибрилл, которые были прослежены, отмечены цветами.)

 

Please register or login to see the hidden video.

(Дополнительное видео 3. На видео показана та же область фибрилл, что и в видео 2, отображающем прослеженные фибриллы в 3D.)

 

Please register or login to see the hidden video.

(Дополнительное видео 4. Видео проходит через секции рядом с одним наблюдаемым концом фибриллы. Фибрилла, о которой идет речь, помечена зеленым кольцом и исчезает ближе к концу видео.)

 

Please register or login to see the hidden video.

(Дополнительное видео 5. На видео показан 3D-рендеринг оканчивающейся фибриллы. Обратите внимание, что 3D-контур был сделан шире, чем фактическая фибрилла для ясности.)

 

Please register or login to see the hidden video.

(Дополнительное видео 6. На видео показана петлевая фибрилла. Первоначально видео проходит через стек в 2D с двумя сторонами фибриллы, отмеченными зеленым цветом (одна в правом верхнем углу, другая в левом нижнем углу). Впоследствии видео показывает петлю фибриллы в 3D. Обратите внимание, что 3D-контур был сделан шире, чем фактическая фибрилла для ясности.)

 

Please register or login to see the hidden video.

(Дополнительное видео 7. На видео видно, как большая фибрилла меняется от обычной до очень неправильной формы.)

 

Please register or login to see the hidden video.

(Дополнительное видео 8. На видео показана точка ветвления фибриллы. Фибрилла, о которой идет речь, помечена зеленым кольцом, поскольку она проходит через стопку 2D-изображений и примерно на полпути через ветви в два.)

*****

Я думаю это нечто большее, чем можно было дать о коллагене. Проведено много работы и думаю не зря, всё очень показательно и визуализировано.

  • Лайк 1
  • Пасеба 1
Link to comment
7 минут назад, Трунд сказал:

Странно, что после тренировки в среду новый миллиметр не проявил себя в четверг. График 2/2 явно лучше заходит, чем чередующийся 2/1 на 2/2 и обратно.

У меня нет четкого графика, так как в работе с живой тканью это заведомо провальная идея. Я ориентируюсь на состояние ПЧ. Одно правило незыблемо - 3 дня перерыва в неделю всегда, остальное только как дополнение если я чувствую, что это необходимо. Вообще, чем дольше перерыв тем лучше.

7 минут назад, Трунд сказал:

А вот с этим моментом есть смысл быть внимательным. Могут возникнуть пятна. Стоит лишь не долечить пузыря, поделать мануалки и привет пятно, которое потом годами не сходит. В последний раз у меня было точно так же, почему и решил притормозить на недельку. Явного и отчётливого пятна нет, но вот едва заметный оттенок, отличающийся от основного, всё же выделяется.

Было пятно после предыдущего пузыря, сошло через неделю окончательно. Я самые сильные нагрузки даю только на последнем 10 минутном этапе и стараюсь быть максимально бережлив с головкой (на сколько это возможно).

  • Лайк 4
Link to comment

@Sweetпривет)))) очень рад тому ,что твой прогресс не замедляется!!!! хорошо идешь:bomb:

когда планируешь предоставить замеры по всем параметрам))??оч интересно)))

Link to comment

@Sweet 

В 19.10.2020 в 00:33, Sweet сказал:

Я ориентируюсь на состояние ПЧ.

И как ты понимаешь тренить сегодня или нет, на что конкретно ориентируешься? А то состояние - понятие растяжимое в прямом и переносном смысле.:D

В 19.10.2020 в 00:33, Sweet сказал:

Было пятно после предыдущего пузыря, сошло через неделю окончательно.

Считай, что повезло. У меня пятна годами держатся.

 

Link to comment
12 часов назад, Трунд сказал:

И как ты понимаешь тренить сегодня или нет, на что конкретно ориентируешься?

Что касается отдыха, я бы посоветовал всем отдыхать столько, сколько позволяет состояние. Нет необходимости каждый день работать с любым методом, который был выбран на пути. Это абсолютно точно выяснено на мне самом. Чем больше дней отдыха даётся тем несомненно лучше. Со своим методом я не могу заниматься растяжкой больше 3-ех дней. Это просто слишком много для меня как на физическом уровне так и просто на психоэмоциональном. Объясню, у меня максимально приближенная к точному выполнению тренировка, требующая полной конфиденциальности, это не так просто как может показаться. Слишком много оборудования в работе и концентрация, она уходит за эти полтора часа, что я посвящаю своему ПЧ. Я не маньяк, и не живу один. У меня так же как и у всех есть семья которой уделяется время. Так же, у меня есть четкое представление о том, что я делаю, я изменяю структуру коллагена не вмешиваясь во внеклеточный матрикс, по крайней мере стремлюсь к этому. Тренировка максимально безвосполительна. Единственная неизвестная это адаптация внеклеточного матрикса под видоизмененный коллаген. ВКМ подстраивается под него. Почему для меня это не известная, потому что есть основания полагать, что для мягкой работы с ВКМ нужно давать еще больше отдыха чем даю я между тренировками. Это либо будет исполнено, либо отложится в долгий ящик, но оно будет протестированно. Так же, учитывается просто общее состоянии ПЧ. То, что я ощущаю лично сам, то 2 дня перерыва просто необходимы для меня, как для перезагрузки, так и для тканей. В моём плачевном положении с тросом нужно избегать любого необдуманного шага, а отдых, сколько бы он не длился никогда не будет ошибкой.

Думаю подробно и описательно.

12 часов назад, Трунд сказал:

Считай, что повезло. У меня пятна годами держатся.

Потому что ты переусердствуешь, в том числе и с помпой. Азарт всегда играет злую шутку. Мой ПЧ страдает непроходимым потемнением от долгих и ужасных сетов клемпо-джелка уже 5 лет как я отбросил это помешательство сосудистыми. Такую ошибку я уже не совершу, но никто из нас не идеален, но мы и толкаем нуп вперед. Главное, чтобы на ошибках учились.

  • Лайк 4
Link to comment

@Sweet Полностью согласен, не надо до остервенения  долбить свой член. НУП должен приносить удовольствие, а не травмы.  У всех участников форума разная физическая подготовка и разное состояние здоровья ,я имею вввиду молодых парней. Да ,я убедился НУП работает и при чем я не истязал себя сверх нагрузками. Во время трена я отводил избыточную знергию от половых органов   по энергетическим каналам .  И ПЧ у меня вырос на 3см от 02.20. И подруге по три раза за ночь не спуская засаживаю. Результатом трена по НУП должна быть стойкая эрекция и секс в удовольствие.  В этом и жизнь !Парни, берегите себя, не долбите ПЧ на каменной эрекции- отводите сексуальную энергию во внутренние органы, делайте перерывы НУП . Осень на дворе выведите свою подругу в осениий парк листьями пошуршать, а вечером засадите ей по самые. Режим труда и отдыха надо соблюдать. Делайте больше перерывов ,а в перерывах тренируйте мышцы таза  или любые упражнения от простатита это позволит вам в прямую не долбить ПЧ ,а косвенно его все равно разрабатывать, полагаю и после этих упражнений лучше пойдет в рост и ПЧ.

Please register or login to see the hidden attachment.

Please register or login to see the hidden attachment.

  • Лайк 3
Link to comment

@Sweet 

23 часа назад, Sweet сказал:

Думаю подробно и описательно.

Вполне.

23 часа назад, Sweet сказал:

Потому что ты переусердствуешь, в том числе и с помпой.

На первый взгляд действительно может показаться, что это последствия помпирования, но нет. Все косяки, не считая пузырей, у меня от мануалки. Причём в одном конкретном месте появляется наполненный кровью пятак 1х1.5 см. И это с учётом того, что в начале нупа у меня головка вывозила любые нагрузки и даже самых мелких точек не было.

  • Лайк 1
Link to comment
57 минут назад, Трунд сказал:

И это с учётом того, что в начале нупа у меня головка вывозила любые нагрузки и даже самых мелких точек не было

Как и у всех нас, у всех нас...

Link to comment
2 часа назад, drill сказал:

Как планируешь eg увеличивать?

На данный момент времени это не входит в мои планы. Но когда это будет, это будет так же "необычно". Будет так же много инструментов, возможно опровержение целесообразности джелка для роста (не тонуса). Нужно будет всё, от зажимов до помп, и что-нибудь еще для работы в радиальном направлении.

Пока, понимая то, как растёт ткань, не исключая нюансов (уникальной анатомии или ограничивающих факторов) я определенно знаю, что ПЧ растёт в объёме. Увеличение туники в длину не будет работать однонаправленно, не получится растить длину и только, как не получится растить только обхват. Даже если вы стали свидетелем того, что нупер пишет, что увеличил только что-то одно, это не правда. И это не умышленный обман, просто тут вопрос в точности, опустим.

На ПЧ слабо поддаются законы физики твердых материалов, потому как это живой организм и нужно отталкиваться от биомеханики. Клеточная структура имеет трехмерную модель. Вектор клеточной пролиферации невозможно задать какими-то упражнениями, было бы глупо спорить с природой. Человеческий ПЧ действительно сложное устройство в плане конструкции, прежде чём получить рост, мы создаём напряжение. Даже если не говорить о слое с радиально направленными и слое с продольно направленными волокнами при упражнении на растяжку - создается напряжение везде. Ткань сужается при напряжении, чтобы потом стать больше, тут работает эффект Пуассона, я убеждён в этом, это трудно объяснить на живом организме аргументируя биологией, поэтому легче взять физику. Я сразу оговорюсь, что именно так буквально на живом организме это не работает, но описание достаточно понятное. Вследствие эффекта Пуассона напряжение нельзя связывать только с деформацией в одном направлении независимо от деформаций в других направлениях. Если напряжения действуют только в одном направлении, как при определении модуля Юнга, то они вызывают деформацию не только в направлении действия напряжений, но и в поперечном направлении. Если поперечные деформации исключены или ограничены, как, например, при наличии связи между слоями, то в поперечном направлении возникают напряжения. В этих двух случаях взаимосвязь напряжение-деформация в главном направлении, будет различной. Простыми словами, увеличив BPFSL я определённо что-то получу в EG и конечно в BPEL.

  • Лайк 5
Link to comment

Месячные замеры

Не успел выложить, так как дописывал сообщение о коллагене и просто не было времени оформить это в журнале.

BPEL 18 см => 18,1 см
BPSFL 18 см-> 18,7 см

EG => 12,8 см

  • Под головкой 12,3 см
  • Середина 12,8 см
  • Основание 13,3 см

Усредненно как: 12,8 см (среднее арифметическое)
Объем ПЧ: 218 см³

Измерения проводились в среду спустя 3 полных дня отдыха.

Это был тяжелый месяц практического обучения и результаты меня поражают в глубине души, хоть я это и не показываю. Я не переживаю за BPEL, так как всё затевалось для увеличения BPFSL, это главный катализатор роста и увеличив его, я с легкостью начну формировать объёмный BPEL. Я точно понимаю, что увеличиваю сейчас именно тунику, так как BPEL не может догнать растянутый BPFSL, это открывает мне глаза на то, что раньше, будучи так же с рождения ограниченным тяжелым дорсальным утолщением, я тем не менее умудрялся увеличивать длину (одновременно BPEL и BPFSL). Простейшее объяснение приходит на ум - связки и внутренняя часть ПЧ. Кажется я взял всё что мог своими ухищрениями за эти года, что бы вырасти любыми способами не включая голову именно за счёт связок и внутренней части. Видимо они оказались слабее моего характера. Это так же объясняет мою старую интуитивную озабоченность о том: "а на всегда ли нынешний размер, вырощенный огромным трудом", ведь связки наиболее "пружинные" чем туника. Поразительно, чего можно достичь посвящая львиную долю жизни какому-то делу. Желаю каждому прочитавшему удачи, роста и целеустремленности.

  • Лайк 9
Link to comment

Create an account or sign in to comment

You need to be a member in order to leave a comment

Create an account

Sign up for a new account in our community. It's easy!

Register a new account

Sign in

Already have an account? Sign in here.

Sign In Now
  • Recently Browsing   0 members

    • No registered users viewing this page.
×
×
  • Create New...